青海湖嗜盐菌多样性与四氢嘧啶的生物合成机制研究：

青海湖是我国境内最大的内陆咸水湖,地处青藏高原东北隅,海拔3194m、面积4282.3km2,是国家自然保护区,被国际重要湿地名录收录。内蒙古嘧啶青海湖是青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)生物多样性最丰富的宝库之一,水体与土壤中栖息有嗜盐、嗜冷和嗜碱等多种环境微生物,并且这些微生物具有典型的生理生化特点和特殊环境适应性。嗜盐微生物(Halophiles)是一类新型的极端环境微生物(Extremophiles)、因其应用广泛而颇受关注,如在嗜盐机理、嗜盐菌素(Halocin)、相溶物质(Compatible solute)、细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin)等基础研究；如在精细化工、环境生物治理、生物电子和医药工业等应用研究方面。鉴于高原地区生态环境的优势,针对青海湖嗜盐菌的生长特性、种群多样性、系统进化和相容溶质四氢嘧啶(Ectoine)合成机制的相关研究,具有重要的基础研究意义。同时,了解与掌握区域微生物的种群多样性,对于制定地区的自然保育政策,以及开展生物多样性保护与生物自然资源的应用开发,提供重要的参考依据。 内蒙古嘧啶本论文系统综述了嗜盐细菌的生存环境、基本分类以及渗透压调节机制的研究现状,并重点讨论四氢嘧啶生物合成与分解代谢、合成转录调节机制、内蒙古玉嘧磺胺工业化生产菌株以及过量化生产策略的研究进展。通过分析青海湖嗜盐细菌的存在现状、生长优势种群、胞内四氢嘧啶的积聚与影响因素,以及解析四氢嘧啶生物合成ect操纵子的结构特征与调节模式等初步研究,获得了以下主要成果： 1)本研究首次从青海湖水体中分离筛选嗜盐菌种资源,分析青海湖可培养嗜盐菌的种群多样性。利用OSM培养基(Oesterhelt-Stoeckenius medium)获得了35株青海湖嗜盐菌种质资源,并构建了青海湖嗜盐菌的种群系统发育树和确定其进化定位。青海湖嗜盐菌以中度嗜盐菌为主,约占62.9%；轻度嗜盐菌次之,约占22.9%；耐盐菌与非嗜盐菌分别占11.4%和2.9%。根据16S rRNA序列的系统发育,分析表明：Y-变形菌纲(y-Proteobacteria)菌株最多,约占68.6%；芽孢杆菌纲(Bacilli)次之,约占17.1%；放线菌纲(A ctinobacteridae)、α-变形菌纲(a-Proteobacteria)和散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)的类群才¨对较少。这些嗜盐菌分属于14个属,其中以海洋螺菌目盐单胞菌属(Halomonas)为优势种群,共计10株。Halomonas作为嗜盐机理与相溶物质Ectoine工业生产的模式生物,已被广泛应用。基于16SrRNA序列同源性分析、16S-23S rRNAISR-RFLP分析和菌体总蛋白SDS-PAGE谱带比较,我们初步认定10株青海湖盐单胞菌可分为7个种进化分支单元,存在潜在的新种。内蒙古嘧啶 2)以优势中度嗜盐菌为材料,研究了相容溶质四氢嘧啶的积聚量与积聚影响条件。采用80%乙醇法抽提胞内四氢嘧啶,HPLC分析表明：大多数青海湖中度嗜盐菌胞内积聚四氢嘧啶,并初步获得5株具有四氢嘧啶高产潜力的野生菌株。以青海湖H. ventosae QHL5为材料,在Na+、K+、Mg2+、pH和温度等不同因素的影响作用下,利用HPLC分析QHL5胞内的四氢嘧啶生物积聚量。在优化条件下,QHL5积聚四氢嘧啶的最大浓度为379.6士8.26mg/L,达到167.1士3.64mg/g细胞干重。 3)利用染色体步移技术,成功地克隆并表达四氢嘧啶的合成ectABC基因簇,构建了青海湖优势嗜盐菌四氢嘧啶合成基因簇物理图谱。青海湖盐单胞菌Halomonas sp. QHL1的ectABC操纵子全长序列3580bp,结构基因ectA(579bp)、 内蒙古氨基嘧啶ectB(1269bp)与ectC(390bp)串联排列,ectA与ectB间隔109bp, ectB与ectC间隔91bp, ectA上游调控序列635bp。基于生物信息学预测分析知：两个启动子(67o与838因子控制)和若干未知功能的保守模序存在于QHL1的ect操纵子上游。 4)利用分子克隆技术,构建了四氢嘧啶异源生物合成工程菌株(以Kcoli为宿主)。成功实现了ectA、ectB与ectC基因的异源表达,并构建了重组ectABC基因工程菌(Kcoli BL21/pET-28a (+)-ectABC),分析了耐盐能力。重组ectABC基因工程菌与对照Kcoli BL21相比,具有较高的盐耐受能力,但胞内四氢嘧啶合成量却偏低,尚需深入研究。内蒙古嘧啶重组嗜盐工程菌的耐盐能力和四氢嘧啶合成量的研究,为后续的开发和利用奠定了良好的基础,并提供了一定的技术支持。