水产品中三类内蒙古氨基嘧啶重要化学残留物快速检测方法的研究：

水产养殖业近年来蓬勃发展,但同时面临着国际贸易技术壁垒的不断增强以及国内由于药物滥用而导致的各类水产品安全问题的巨大挑战。内蒙古氨基嘧啶“打铁还要自身硬”。最彻底的解决办法还是建立合适的检测方法和监管体系加以防范,从根本上杜绝隐患。氯霉素、孔雀石绿、磺胺二甲基嘧啶和磺胺二甲氧嘧啶作为水产品中残留问题较为突出的药物,建立更加严格的筛查办法已势在必行。酶联免疫分析法和侧流免疫分析法用于检测这三大类化学残留物具有便捷快速,高效稳定等特点,适合水产品残留的现场检测。本课题从高效抗原的合成和筛选着手,经过细胞融合后,进一步筛查制备单克隆抗体,并开发相应的快速检测方法。首先从特征性功能基团着手,通过混合酸酐法和碳二亚胺法等方法,以不同的摩尔反应比合成多种氯霉素抗原,经过紫外和凝胶电泳法鉴定后免疫动物,通过ELISA检测筛选免疫效果好的免疫原、对应的检测抗原和免疫小鼠。经过细胞融合和亚克隆,筛选出超灵敏的抗氯霉素单克隆抗体6F11。内蒙古嘧啶通过对主要影响因素的优化,确定了工作条件为:以CAP-OVA作为检测抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀释后进行包被,实验过程中调节洗液和抗体稀释液的p H至7.0,显色时间为15 min。在优化条件下,ic-ELISA方法的IC50为0.010 ng/m L,线性范围(IC20~IC80)为0.003 ng/m L~0.040ng/m L。其对氯霉素三种结构类似物(FFC、FFA和TAP)都没有交叉反应。通过牛奶阴性样本的添加回收实验,ic-ELISA方法的回收率在98.9%~106.8%之间,变异系数小于10%。为节约大批量样本的现场检测时间,研究并建立了一步法检测的标准曲线,单抗的IC50为0.025 ng/m L,线性范围为0.009 ng/m L~0.067 ng/m L。内蒙古氨基嘧啶基于侧流免疫原理建立了氯霉素金标试纸条,金标抗体的工作条件为:1 m L胶体金溶液中,0.1mol/L K2CO3添加量为4?L,氯霉素单抗添加量为15?g,NC膜上包被氯霉素检测抗原CAP-BSA浓度为0.8 mg/m L。优化并检测了牛奶中的氯霉素残留,裸眼观察判断检测限为0.3 ng/m L,用T线的颜色深度值建立标准曲线的检测限为0.263ng/m L,线性范围为0.116 ng/m L~0.596 ng/m L。金标试纸条与ic-ELISA法检测结果相一致,可以满足牛奶中氯霉素残留的检测要求。检测鱼肉中的氯霉素残留,裸眼观察判断检测限为0.2 ng/g,检测灵敏度可达到0.1 ng/g,该方法也适于水产品中氯霉素残留的现场快速筛查。以同样的思路制备了高灵敏的抗孔雀石绿单克隆抗体2E10,并建立了鱼肉中孔雀石绿残留的ic-ELISA检测方法。通过对主要影响因素的优化,确定了工作条件为:以CEO50作为检测抗原,以0.01mol/L p H 6.5的PBS溶液稀释后进行包被,实验过程中调节洗液和抗体稀释液的p H至5.0,显色时间15 min。在此条件下,ic-ELISA方法的IC50值为0.057 ng/m L,线性范围为0.02 ng/m L~0.162 ng/m L。其对结晶紫的交叉反应率为90.4%,与其他三苯甲烷类物质没有交叉反应。通过鱼肉样本的添加回收实验,此方法的回收率在98.5%~116.3%之间,变异系数小于10%。基于侧流免疫原理建立了孔雀石绿金标试纸条,金标抗体的工作条件为:1 m L 30 nm胶体金使用浓度为5 nmol/L,酶标二抗添加浓度为0.3 mg/m L,抗体添加浓度为0.2mg/m L,NC膜上包被4.5 mg/m L的检测抗原(CEB30)。通过添加回收建立鱼肉中三苯甲烷类物质残留的检测方法,孔雀石绿总量和结晶紫总量的IC50分别为0.418 ng/g和0.532 ng/g,与孔雀石绿其他类似物无交叉反应。应用于水产品阳性样本检测,确定孔雀石绿的残留量为195 ng/g样本,实验重复性较好。内蒙古玉嘧磺胺筛选高效的完全抗原,进而制备高灵敏的抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体10D6,建立ic-ELISA法检测的IC50值为0.221 ng/m L,线性范围为0.074 ng/m L~0.667 ng/m L,将此方法应用于鱼肉中添加回收实验,平均回收率为79.6%~108.6%,变异系数小于10%。筛选高效的完全抗原,进而制备高灵敏的抗磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体6C11,优化实验条件后,所建立ic-ELISA法检测的IC50值为0.419 ng/m L,线性范围为0.158ng/m L~1.110 ng/m L将此方法应用于鱼肉中添加回收实验,内蒙古氨基嘧啶平均回收率为96.3%~128.1%,变异系数小于10%,表明此方法检测水产品中药物残留的可行性。