接下来，内蒙古嘧啶厂家对5的激酶选择性进行了评价

内蒙古嘧啶发现其激酶选择性很差，从化合物5与JAK1的共晶结构（图4）可以看出，化合物5的氨基嘧啶部分与铰链区形成氢键，吲哚上的NH和酰胺Linker与Asp1021的羧酸侧链形成氢键，并且观察到了吡啶与His885的咪唑侧链之间的相互作用，这一相互作用稳定了P环，使得P环区能够观察到清晰的电子密度。5的吡唑环侧链占据由Phe958、Pro960、Ser961和Gly962形成的小的疏水口袋，而这个小的疏水口袋在JAK2中是由Tyr931、Pro933、Tyr834和Gly934形成的。JAK2中的这个口袋对于取代基的空间要求更高，吡唑环上的甲氧基在其中的耐受性差，从而导致对JAK2的活性降低，提高了化合物对JAK1的选择性。作者为了提高化合物的激酶选择性重新合成了300多个6的酰胺类似物，发现化合物9具有中等的JAK1活性和良好的选择性、水溶性以及稳定性。在化合9与JAK1的共晶结构（图5）中可以看到，吲哚上的NH和酰胺Linker与JAK1的Asp1021氢键相互作用是不变的，有趣的是，手性哌嗪部分和Asp1003之间的盐桥作用也很明显，虽然P环周围的电子密度很明显，但由于该区域缺乏芳香环，配体不能与残基形成直接的π−π相互作用，所以推测化合物9良好的选择性是疏水相互作用，氢键以及环丙酰胺部分共同发挥作用的结果。在9的基础上对Linker和哌嗪取代基进一步探索，得到化合物10-14（表2），发现其活性和选择性都差于化合物9。

于是，在化合物9的基础上，作者重新对嘧啶环2位上的取代基进行了改造。首先引入甲基吡啶取代基得到化合物15，发现其对于JAK1具有高度的选择性，但是JAK1活性却下降了，只有0.13 μM。将甲基换成较小的取代基氟以后，活性和选择性都有改善，但是对于HERG离子通道有抑制作用(IC50=10 μM)。而引入2-甲氧基-1-甲基氨基吡唑形成化合物17，发现其活性和选择性良好，对于HERG离子通道无抑制作用。（表3）

接下来，作者对嘧啶环5位上的取代基进行了探索，内蒙古嘧啶因为JAK1具有蛋氨酸守门残基，因此，疏水取代基或氢可能在C-5位置上是有利的。如表4所示，取代基的疏水性增加导致JAK1活性更高(18、19和20的IC50分别为7、19和8 nM)，然而，也观察到JAK2活性具有相同的趋势，并且18、19和20对于HERG离子通道也具有一定的抑制作用。总体而言，具有C5-H取代基的21表现出良好的JAK1活性、选择性，并且没有检测到HERG活性。因此，作者选择对它进行进一步的分析。

化合物21在不同物种的肝细胞中表现出较高的稳定性，溶解性和透膜性良好（表5）。具有良好的跨物种药代动力学特性(表6)，在大鼠体内清除率低(20mL/min/kg)，半衰期适中(6h)，口服生物利用度高。同样观察到21在犬体内的低清除率(9 mL/min/kg)，长半衰期(9 h)，高口服利用度(71)。

为了了解化合物21的抗肿瘤活性，在NCL-H1975小鼠模型中评价了21与EGFR第三代抑制剂osimertinib联合治疗时的疗效（图6）。在联合治疗组中，与单独使用osimertinib（红色）相比，联合使用21增强了抗肿瘤活性（绿色），但是单独使用21时的抗肿瘤活性较弱（蓝色）。在治疗的后一天，联合用药对肿瘤生长的抑制作用与单药22相比具有更强的抗肿瘤活性。所有治疗耐受性良好，在治疗过程中没有观察到明显的体重减轻。

从一个初筛得到的化合物3出发，通过基于结构的设计方法，得到了活性和选择性都较高的先导化合物9，为了进一步提高活性和选择性，通过继续优化，发现了具有高度JAK1抑制活性和良好的DMPK特性的候选药物21(AZD4205)。在临床前NSCLC模型中，该化合物与批准的EGFR抑制剂osimertinib联合使用显示出增强的抗肿瘤活性，内蒙古嘧啶这些发现值得在临床试验中对化合物21开展进一步的研究。